Centro per la procreazione assistita ProAndros

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STERILITA’ MASCHILE AZOOSPERMIA

In questi anni, l’attenzione si è spostata in modo imponente sulla possibilità di risolvere le gravi forme di infertilità maschile.

L’azoospermia, patologia caratterizzata dalla completa assenza di spermatozoi nell’eiaculato, è presente nel 5% delle coppie desiderose di gravidanza e nel 10-20% nei soggetti infertili che effettuano un’analisi del liquido seminale.

Viene solitamente suddivisa, in base alla natura dell’alterazione, in:

1. azoospermia secretiva o non-ostruttiva, caratterizzata dalla completa assenza di spermatozoi; solitamente causata da insufficienza ipofisaria o testicolare primitiva

2.azoospermia ostruttiva da ostruzione del sistema di escrezione

Si parla di azoospermia non-ostruttiva o di insufficienza testicolare primitiva, quando si realizzano tre criteri diagnostici fondamentali: azoospermia, atrofia testicolare ed elevati livelli di FSH. In queste forme gli spermatozoi sono assenti anche a livello dell’epididimo e sono rinvenibili sono sparsi focolai di spermatogenesi a livello testicolare. Un fallimento nel recupero degli spermatozoi è un’evenienza possibile in pazienti con tale patologia.

Un’azoospermia ostruttiva si evidenzia per l’assenza di cellule seminali nell’eiaculato, normale trofismo testicolare ed FSH nei limiti della norma. La spermatogenesi è regolare ed i pazienti presentano una normale virilizzazione con fisiologici livelli di testosterone.

La forma congenita principale di azoospermia ostruttiva è l’assenza bilaterale dei dotti deferenti (CBAVD: Congenital Bilateral Absence Vas Deferens), che ha un’incidenza del 1.4% fra gli azoospermici.

Tecniche più comuni di recupero degli spermatozoi dall’epididimo e dal testicolo

1.MESA, Microsurgical epididymal sperm aspiration

2.PESA, Percutaneous epididymal sperm aspiration

3.TESE, Testicular sperm extraction

4.TESA, Percutaneous testicular sperm aspiration

In seguito a prelievo degli spermatozoi, dall’epididimo o dal testicolo, la successiva fecondazione viene effettuata mediante ICSI.

TESA TESE

Tecniche chirurgiche di recupero degli spermatozoi dal testicolo

Nei pazienti con azoospermia ostruttiva in cui il prelievo epididimale ha dato esito negative, o in quelli con azoospermia non ostruttiva, in cui a livello dell’epididimo è pressocchè impossibile ritrovare spermatozoi, il recupero dei gameti può essere effettuato direttamente dal testicolo.

Anche in questo caso, le metodiche di prelievo possibili sono due:

1.Una via transcutanea o FNA (Fine Needle Aspiration)

2.Una via chirurgica o micro-chirurgica o TESE (Testicular Sperm Extraction)

TESA/FNA (Testicular Percutaneous Sperm Aspiration/Fine Neddle Aspiration)

La tecnica è molto simile alla PESA. Viene eseguita sotto anestesia generale o locale. Il chirurgo mantiene fermo il testicolo fra pollice e indice, ponendo l’epididimo posteriormente. Si inserisce un ago da 22 o 23 G, collegato ad una siringa di 20 ml contenente 0.1 ml di terreno di coltura, lungo l’asse maggiore del testicolo. L’ago viene poi orientato in diverse direzioni in modo da prelevare spermatozoi da differenti tubuli seminiferi. Il materiale aspirato è osservato al microscopio per verificare la presenza degli spermatozoi. Il prelievo viene ripetuto fino ad avere un adeguato numero di spermatozoi. La tecnica consente nel 95% dei casi di azoospermia ostruttiva un recupero dei gameti. Nel caso in cui non si dovessero recuperare spermatozoi, è indicato un tentativo mediante TESE.

TESE (Testicular Sperm Extraction)

I pazienti per cui è indicato un prelievo di spermatozoi mediante TESE possono dividersi in due categorie:

1. soggetti in cui non è possibile effettuare il recupero dall’epididimo per pregressi trattamenti epididimali o ostruzione congenita dei dotti efferenti;

2.soggetti con diagnosi istologica di sindrome da sole cellule Sertoli, con arresto della maturazione o ipospermatogenesi severa;

Un pazienti con azoospermia non-ostruttiva il recupero degli spermatozoi dal testicolo è attuabile secondo due possibili metodiche:

1.mediante una serie di piccole biopsie testicolari multiple eseguite in maniera random (TESE)

2.mediante un recupero microchirurgico degli spermatozoi.

In entrambi i casi si ricorre ad una semplice anestesia locale eseguita a livello del funicolo spermatico.

Nella TESE, il testicolo è ruotato in modo da posizionare l’epididimo ed il vaso deferente posteriormente. La biopsia testicolare viene effettuata a carico della porzione mediale o laterale del polo superiore del testicolo.

Si procede ad incidere il parenchima testicolare visualizzato. Il materiale prelevato viene posto su terreno di coltura, e valutato al microscopio. La presenza di spermatozoi in numero sufficiente è indice di intervento riuscito e da non ripetere. In caso contrario, è necessario ripetere il prelievo in un punto differente del testicolo.

Solitamente, un prelievo testicolare viene anche valutato da un punto di vista istologico, come screening per le neoplasie del testicolo. La TESE eseguita in microchirurgia si basa anch’essa su l’esecuzione di un’anestesia locale come indicato in precedenza.

Si esteriorizza il testicolo e si visualizza al microscopio i tubuli seminiferi. Individuati i tubuli ben dilatati si procede ad un piccolo prelievo, senza oltre modo danneggiare il restante tessuto, riducendo così i possibili effetti collaterali menzionati prima.

 

MESA PESA

Tecniche chirurgiche di recupero degli spermatozoi dall’epididimo

Le possibili metodiche di recupero degli spermatozoi dall’epididimo sono due:

1.con metodica microchirugica (MESA)
2. aspirazione transcutanea, in caso di assenza congenita dei deferenti o di un’ostruzione non risolvibile (PESA).

MESA (Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration)

La MESA può essere effettuata sotto anestesia generale o locale.

Dopo avere individuato e sezionato la tunica vaginalis, con il microscopio, mediante un ingrandimento 10x-40x, si seleziona l’epididimo più dilatato, si esegue una microincisione a livello della sierosa epididimale, evidenziando inizialmente i tubuli a livello del corpo e poi, via via, più prossimamente, sino alla testa.

Si seleziona un tubulo sufficientemente dilatato, e si procede alla sua apertura. Gli spermatozoi presenti all’interno vengono così aspirati da un apposito capillare di vetro a punta smussa.

Il materiale prelevato viene immediatamente esaminato per valutare la presenza degli spermatozoi, e la loro motilità e qualità di progressione.

Solitamente è necessario prelevare solo pochi ml, in quanto gli spermatozoi sono altamente concentrati a livello dell’epididimo.

Se la motilità spermatica non è eccellente si procede ad una nuova aspirazione modificando la propria posizione in senso caudo-craniale. Infatti, a livello della testa dell’epididimo, solitamente, si ritrovano gli spermatozoi dotati di maggiore motilità.

I gameti prelevati chirurgicamente vengono trattati in maniera analoga al materiale ottenuto dall’eiaculato.

La completa assenza di spermatozoi, dopo ripetuti tentativi, è un’indicazione all’esecuzione del prelievo dal testicolo.

Il tubulo viene poi suturato.

La tecnica offre il vantaggio di poter eseguire il prelievo intratubulare sotto diretto controllo visivo, di attuare una corretta emostasi e prelevare gli spermatozoi da più siti.

Principale effetto collaterale legato alle caratteristiche strutturali dell’epididimo, regione altamente vascolarizzata, è una possibile contaminazione del prelievo con cellule ematiche.

PESA (Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration)

La PESA presenta il vantaggio di riuscire ad effettuare il prelievo dall’epididimo evitando l’esplorazione chirurgica.

Eseguita una semplice anestesia locale, ed immobilizzato il testicolo, mantenendo l’epididimo fra pollice ed indice, l’operatore procede al prelievo, mediante l’inserimento di un ago.

Si esegue una delicata aspirazione fino alla comparsa del contenuto epididimale.

Il prelievo viene ripetuto fino alla comparsa di spermatozoi.

Il prelievo di spermatozoi dall’epididimo, con metodica MESA o PESA, permette in entrambi i casi la possibilità, quando sono presenti, di ottenere un ampio numero di spermatozoi, che possono essere sia utilizzati al momento che congelati per tentativi successivi di fecondazione assistita.

BIOPSIA TESTICOLARE

Indicazioni

  1. Pazienti azoospermici con testicoli di normale volume e consistenza, dotto deferente palpabile e normali livelli di ormone follicolo-stimolante (FSH).
  2. Pazienti azoospermici con testicoli più piccoli di volume o diminuiti di consistenza e elevati livelli di ormone follicolo-stimolante (FSH).
  3. Pazienti con assenza dei dotti deferenti, l’IVF.

La biopsia dovrebbe essere effettuata bilateralmente

Procedura

La biopsia testicolare a cielo aperto si può effettuare in neuroleptoanalgesia.

Il chirurgo che effettua la biopsia deve prelevare un campione di tessuto adeguato ad operare una tecnica che eviti traumi sia al campione prelevato, sia all’epididimo ed alla vascolarizzazione testicolare.

Un assistente tiene in trazione la cute scrotale strettamente accollata alla parete anteriore del testicolo, assicurandosi che l’epididimo sia posteriore. Incisioni traverse bilaterali di 1 cm danno una buona esposizione con un sanguinamento scrotale minimo. L’incisione viene condotta attraverso la cute e il dartos e viene aperta la tunica vaginale. I bordi della vaginale vengono tenuti divaricati con pinze emostatiche ed i piccoli vasi sanguinanti vengono cauterizzati.

L’area prescelta per la biopsia dovrebbe essere sulla faccia mediale del polo superiore in un punto relativamente povero di vasi superficiali. In questo punto è meno frequente trovare rami principali dell’arteria testicolare che decorrono superficialmente sotto l’albuginea. La tunica albuginea del testicolo viene trafissa con un punto. La ferita deve essere asciugata prima di incidere l’albuginea per prevenire la contaminazione del materiale bioptico da parte del sangue. Si pratica un’incisione di 3-4 mm sull’albuginea con la punta del bisturi.

Un campione di tessuto testicolare viene escisso con forbici affilate e depositato direttamente in piastra contenente terreno di coltura o in provetta con soluzione di fissaggio.

ll tessuto testicolare bioptico da fissare non deve essere manipolato o traumatizzato in alcun modo, in quanto ciò può distorcere l’architettura testicolare. Il materiale prelevato deve essere lasciato cadere direttamente dalle forbici nella soluzione di fissaggio.

Usando il punto di sutura precedentemente ancorato alla tunica albuginea, questa viene chiusa in sutura continua. La vaginale viene chiusa in continua a sopraggitto per garantire l’emostasi.

Le piccole incisioni cutanee vengono chiuse con punti staccati per minimizzare il rischio di ematoma.

 

TRATTAMENTO DEGLI SPERMATOZOI RECUPERATI CON TECNICHE CHIRURGICHE

Nel caso in cui la tecnica applicata preveda l’asportazione di pezzi bioptici vari, questi vengono raccolti in piastre Petri 35x10mm Falcon contenenti 2 ml di Quinn’s Advantage Protein Plus Fertilization Medium termostatato a 37° per 24 ore. Le piastre vengono contrassegnate, anche in questo caso, con la provenienza del prelievo bioptico e passate in laboratorio.

Il contenuto di ciascuna piastra deve essere registrato.

Facendo uso di vetrini portaoggetti sterili il prelievo viene accuratamente strisciato e sminuzzato in modo da recuperare il maggior numero di spermatozoi contenuti all’ interno dei tubuli seminiferi e adesi ad essi.

Alla fine della seguente procedura, che può avvalersi anche dell’ ausilio di pinzette sterili o aghi di siringhe da insulina, si deve ottenere un preparato omogeneo.

Metodo di trattamento del materiale recuperato

Si prelevano 10 microlitri di sospensione e si allestisce un vetrino a fresco, si osservano 100 campi all’invertoscopio con ingrandimento 20X, si determina la presenza di spermatozoi e la percentuale di forme mobili. I dati raccolti devono essere accuratamente registrati.

Si procede quindi a lavaggio del campione:

  • tutta la sospensione viene trasferita in una provetta PROVETTA 15 ML 17X120 MM ST Falcon 352095
  • Si centrifuga per 10′ a 1800 g, si rimuove il sovranatante e si risospende il pellet.
  • Nel caso in cui si proceda alla ICSI, si risospende il pellet in 50 microlitri di terreno tamponato messo in incubatore 37°C per 12h e si allestisce la piastra.
  • Nel caso in cui non si effettui la ICSI lo stesso giorno del prelievo, il pellet si risospende con circa 500 microlitri di terreno tamponato termostatato a 37°C per 12 h, e il campione seguirà la procedura di crioconservazione.

TRATTAMENTO DEGLI SPERMATOZOI RECUOERATI IN VESCICA

RECUPERO DEGLI SPERMATOZOI DALLE URINE

In alcuni soggetti l’eiaculato può refluire in vescica  a causa di una incontinenza del collo vescicale, e ciò causa una azoospermia . La conferma di questa situazione si ottiene esaminando un campione di urine ottenuto subito dopo l’eiaculazione. Le urine possiedono una serie di effetti nocivi sugli spermatozoi, di conseguenza l’esposizione degli spermatozoi all’ambiente acido deve essere minimizzato sia in termini di durata che con una precedente alcalinizzazione delle urine. Il contenitore per raccolta deve essere opportunamente etichettato.

Preparazione della vescica

•             escludere infezioni genito-urinarie

•             effettuare una profilassi antibiotica

•             aumentare l’assunzione quotidiana di liquidi nei tre giorni precedenti la raccolta

•             astinenza sessuale di tre giorni

•             assunzione di bicarbonato di sodio (650 mg  per 4 volte al giorno ) nelle  precedenti 24h la raccolta fino alle ore 6:00 del giorno della raccolta, in cui va assunta l’ultima dose di bicarbonato

•             non appena arrivato in laboratorio il paziente deve attendere che in  vescica sia presente urina e masturbarsi

•             raccogliere le urine in un contenitore e consegnarle in laboratorio.

Procedura operativa

In alcuni soggetti l’eiaculato può refluire in vescica  a causa di una incontinenza del collo vescicale, e ciò causa una azoospermia . La conferma di questa situazione si ottiene esaminando un campione di urine ottenuto subito dopo l’eiaculazione. Le urine possiedono una serie di effetti nocivi sugli spermatozoi, di conseguenza l’esposizione degli spermatozoi all’ambiente acido deve essere minimizzato sia in termini di durata che con una precede alcalinizzazione delle urine.

Metodo              

•             misurare le urine e fare aliquote da 10 ml in provette a fondo conico da centrifuga

•             centrifugare a 1500 rpm per 10’

•             eliminare i sovranatanti e risospendere i pellett in 5ml di Quinn’s Sperm Washing Medium

•             centrifugare a 1500 rpm per altri 10’

•             recuperare tutti i sedimenti  in 1.0 ml di Quinn’s Sperm Washing Medium in un’unica provetta a fondo conico

•             eseguire un’analisi seminale standard su questa sospensione  con camera di Burker.

Calcolo del recupero (% di spermatozoi mobili dopo trattamento)

Recupero% = v x c x pm%

Vx C x PM %

v           = volume prep. spermatica

V           = volume campione

c            = concentrazione spermatozoi campione trattato (mil/ml )

C           = concentrazione spermatozoi campione seminale

% pm    = motilità progr campione trattato

%PM    = motilità progr campione seminale.